Xromatografiya moddalarni ajratish usullaridan biridir. U mikrozarrachalarning fizik va kimyoviy xossalarini keyingi sifat va miqdoriy tahlil qilish uchun ishlatiladi. Ushbu texnologiyaning o'zgarishi yaqinlik xromatografiyasidir. Protein birikmalarini molekulyar yaqinlik xususiyatidan foydalangan holda farqlash g'oyasi fanda bir necha o'n yillar davomida ma'lum bo'lgan. Biroq, u o'z rivojlanishini faqat so'nggi yillarda, matritsa sifatida ishlatiladigan yuqori gözenekli hidrofilik materiallar joriy etilgandan keyin oldi. Bu usul ham analitik masalalarni (moddalarni ajratish va ularni identifikatsiya qilish), ham preparativ masalalarni (tozalash, kontsentratsiya) echishga imkon beradi.
Essensiya
Affinis xromatografiyasi (lotincha affinis - “qoʻshni”, “bogʻliq” soʻzidan) yaqinlik oʻzaro taʼsiriga asoslangan boʻlib, ular ajratuvchi molekula (ligand yoki affinant) va maqsadli molekula oʻrtasida yuqori oʻziga xos bogʻlanishlar hosil boʻladi. Bu mexanizmlar tabiatda keng tarqalgan (mediatorlar yoki gormonlar va retseptorlarning ulanishi, antikorlar vaantijenler, polinukleotidlarning gibridlanishi va boshqa turdagi jarayonlar). Tibbiyotda yaqinlik xromatografiyasi 1951 yildan beri amaliy maqsadlarda qo'llanila boshlandi
Qismlar quyidagicha ajratilgan:
- izolyatsiya qilinadigan moddani o'z ichiga olgan ishchi eritma sorbent orqali o'tkaziladi;
- sorbent matritsasida to'plangan ligand bu moddani saqlab qoladi;
- u konsentrlangan (to'planish);
- sorbentdan ajratilgan moddani erituvchi bilan yuvish orqali ajratib olish.
Bu usul butun hujayralarni ajratish imkonini beradi. An'anaviy sorbsion xromatografiyadan farqi shundaki, ajratilgan komponentning sorbent bilan kuchli biospesifik bog'lanishi mavjud bo'lib, u yuqori selektivlik bilan ajralib turadi.
Adsorbentlar
Adsorbent sifatida quyidagi moddalar ishlatiladi:
- Agardan olingan polisakkarid bo'lgan agaroza asosidagi gel birikmalari. Eng ko'p ishlatiladigan 3 nav: sepharose 4B, CL (o'zaro bog'langan agaroza) va affi-gel. Oxirgi kompozitsiya agaroz va poliakrilamidning o'zgartirilgan jelidir. U yuqori biologik inertlikka, yuqori kimyoviy va termal qarshilikka ega.
- Kremniy (silikagel).
- Shisha.
- Organik polimerlar.
Ligandlar bilan aloqa qilishda mexanik to'siqlarni bartaraf etish uchun uni tashuvchidan ajratish uchun qo'shimcha moddalar qo'llaniladi (peptidlar, diaminlar, poliaminlar, oligosakkaridlar).
Uskunalar
Affinity xromatografiya uskunasi quyidagi asosiy birliklarni o'z ichiga oladi:
- Mobil faza uchunsaqlash tanklari (eluent);
- o'rta ta'minot uchun yuqori bosimli nasoslar (ko'pincha pistonli);
- eluentlarni changdan tozalash uchun filtr;
- dozalash moslamasi;
- aralashmani ajratish uchun xromatografik ustun;
- ustundan chiqib ketayotgan ajratilgan komponentlarni aniqlash uchun detektor;
- xromatogramma yozuvchilari va mikroprotsessor bloki (kompyuter).
Erigan havo miqdorini kamaytirish uchun geliy birinchi navbatda mobil fazadan o'tkaziladi. Eluent kontsentratsiyasini o'zgartirish uchun dasturchi tomonidan boshqariladigan bir nechta nasoslar o'rnatiladi. Xromatografik ustunlar zanglamaydigan po'latdan (korroziyaga chidamlilik talablarini oshirish uchun), shishadan (universal variant) yoki akrildan tayyorlanadi. Tayyorgarlik maqsadida ularning diametri 2 dan 70 sm gacha o'zgarishi mumkin. Analitik xromatografiyada Ø10-150 mkm mikroustunlar qo'llaniladi.
Detektorlarning sezgirligini oshirish uchun aralashmaga reagentlar kiritiladi, ular spektrning ultrabinafsha yoki koʻrinadigan hududida koʻproq nurlarni yutuvchi moddalar hosil boʻlishiga yordam beradi.
Metodologiya
Suyuqlikka yaqinlik xromatografiyasining ikkita asosiy turi mavjud:
- Ustun, unda ustun statsionar faza bilan to'ldirilgan va aralash oqim bilan u orqali o'tkaziladieluent. Ajralish bosim ostida yoki tortishish ostida sodir bo'lishi mumkin.
- Yupqa qatlam. Eluent kapillyar kuchlar ta'sirida tekis adsorbent qatlami bo'ylab harakatlanadi. Adsorbent shisha plastinka, keramika yoki kvarts novda, metall plyonkaga surtiladi.
Ishning asosiy bosqichlariga quyidagilar kiradi:
- adsorbentni tayyorlash, ligandni tashuvchiga mahkamlash;
- ajratish aralashmasini xromatografik ustunga berish;
- mobil fazani yuklash, komponentni ligand bilan bog'lash;
- bog'langan moddani ajratish uchun fazani almashtirish.
Maqsad
Affinlik xromatografiyasi quyidagi turdagi moddalarni ajratish uchun ishlatiladi (ishlatilgan ligand turi qavs ichida ko'rsatilgan):
- enzimatik ingibitorlar, substratlar va kofaktorlarning (fermentlarning) analoglari;
- genetik begonalik belgilariga ega bioorganik moddalar, viruslar va hujayralar (antikorlar);
- yuqori molekulyar uglevodlar, monosaxarid polimerlari, glikoproteinlar (lektinlar);
- yadro oqsillari, nukleotidiltransferazalar (nuklein kislotalar);
- retseptorlar, transport oqsillari (vitaminlar, gormonlar);
- hujayra membranalari (hujayralar) bilan o'zaro ta'sir qiluvchi oqsillar.
Ushbu texnologiya immobilizatsiyalangan fermentlarni olish uchun ham qoʻllaniladi va ularni tsellyuloza bilan bogʻlash immunosorbentlar ishlab chiqarish imkonini beradi.
DNK-bog'lovchi oqsillarning xromatografiyasi
DNK-bog'lovchi oqsillarni izolyatsiyalash yordamida amalga oshiriladigeparin. Ushbu glikozaminoglikan keng molekulalarni bog'lash qobiliyatiga ega. Ushbu guruh oqsillarining yaqinlik xromatografiyasi quyidagi moddalarni ajratish uchun ishlatiladi:
- translyatsiyani boshlash va cho'zish omillari (nuklein kislota molekulalari va oqsillarni sintezi);
- restriktazalar (ikki zanjirli DNKdagi ma'lum ketma-ketlikni taniydigan fermentlar);
- DNK ligazalari va polimerazalar (yangi kimyoviy bog'lanish hosil qilish uchun ikkita molekulaning qo'shilishini katalizlovchi va DNK replikatsiyasida ishtirok etadigan fermentlar);
- Immun va yallig'lanish jarayonlarida muhim rol o'ynaydigan serin proteaza inhibitörleri;
- o'sish omillari: fibroblast, Schwann, endotelial;
- hujayradan tashqari matritsaning oqsillari;
- gormon retseptorlari;
- lipoproteinlar.
Qadr-qimmat
Bu usul reaktiv birikmalarni (fermentlar va kattaroq agregatlar - viruslar) izolyatsiya qilish uchun eng xos usullardan biridir. Biroq, u nafaqat biologik faol moddalarni ajratish uchun ishlatiladi.
Kichik miqdorda antikorlarni aniqlash, poliadenil kislotani miqdoriy baholash, dehidrogenazalarning molekulyar massalarini tez aniqlash, ayrim ifloslantiruvchi moddalarni olib tashlash, tripsinning faol bo'lmagan shaklini faollashtirish kinetikasini o'rganish, insonning molekulyar tuzilishi. interferonlar - bu yaqinlik qo'llaniladigan tadqiqotlarning to'liq ro'yxati emas xromatografiya. Klinikada foydalanish uning afzalliklari bilan bog'liq, masalan:
- Samarali tozalash qobiliyatioqsillar, polisaxaridlar, nuklein kislotalar. Ular fizik-kimyoviy xossalarida bir oz farq qiladi va gidroliz, denaturatsiya va boshqa usullarda qoʻllaniladigan davolashning boshqa turlarida faolligini yoʻqotadi.
- Maddalarning ajralish tezligi, jarayonning dinamik tabiati.
- Ajralish konstantalarini aniqlash uchun maxsus fermentlarni tozalash va izoenzim gomogenizatsiyasiga ehtiyoj yo'q.
- Keng turdagi moddalarni ajrata oladi.
- Ligandlarning kam iste'moli.
- Katta hajmdagi moddalarni ajratish imkoniyati.
- Biologik makromolekulalar bogʻlanishining teskari jarayoni.
Ushbu usul qoʻshimcha maydonni (gravitatsion, elektromagnit) oʻrnatish uchun boshqalar bilan birlashtirilishi mumkin. Bu sizga xromatografiyaning texnik imkoniyatlarini kengaytirish imkonini beradi.
Enzimatik muhandislik
Ushbu usul tufayli biotexnologiyaning yangi tarmogʻi - ferment injeneriyasining faol rivojlanishi boshlandi.
Ferment izolyatsiyasi uchun yaqinlik xromatografiyasi quyidagi afzalliklarga ega:
- kamroq vaqt natijasida fermentlarni ko'p miqdorda olish, natijada - ularning narxining pasayishi;
- fermentlarning immobilizatsiyasi ularni tibbiyot va sanoatda qoʻllash doirasini sezilarli darajada kengaytirishi mumkin;
- Fermentlarning erimaydigan qattiq tayanch bilan bogʻlanishi tabiiy va fiziologik jarayonlarda muhim rol oʻynaydigan mikromuhit taʼsirini va reaksiyalar yoʻnalishini oʻrganish imkonini beradi.
