PCR yoki polimeraza zanjiri reaktsiyasi tibbiyot va boshqa ilmiy sohalarda keng qo'llaniladigan murakkab laboratoriya usulidir. Bir vaqtlar PCR diagnostikasi fanda haqiqiy yutuq bo'ldi.
Tavsif
Kantitativ PCR - real vaqt rejimidagi PCR turi.
Bu PCR varianti sifatida tushuniladi, unda reaksiya kinetikasi doimiy ravishda qayd etiladi, bu esa murakkab molekulyar aralashmadagi o'ziga xos DNK nukleotidlar ketma-ketligi tarkibini sifat jihatidan baholash imkonini beradi.
Kantitativ PCR usuli quyida batafsilroq muhokama qilinadi.
Tahlilning mohiyati
Madaniy va serologik usullar, ayniqsa infektsiyalarni tashxislashda qo'llaniladi. Birinchisi ostida qon zardobidagi yuqumli patogenga antikorlar aniqlanadi. Ikkinchisida, kasal odamdan olingan biologik material patogen koloniyalarning o'sishi uchun qulay bo'lgan o'ziga xos muhitni ekish uchun ishlatiladi. Ikkalasida diagnostikaish kun yoki hafta davom etishi mumkin.
PCR tekshiruvi kasal odamdan olingan turli xil biologik materiallar yordamida amalga oshirilishi mumkin. Qon va boshqa patologik, fiziologik va biologik muhitlar va suyuqliklar namunalar sifatida ishlaydi. Siz najas yoki siydikni PCR bilan tekshirishingiz mumkin.
Atipik va virusli infektsiyalar ko'pincha miqdoriy PCR bilan tashxis qilinadi, chunki ular tomonidan qo'zg'atilgan patologik jarayonning o'ziga xos xususiyati tufayli tashxis qo'yish oson bo'lmasligi mumkin. Bunday infektsiyalarni aniqlash uchun vaqt kerak bo'ladi, bu vaqt davomida organizmda serologik usullar bilan aniqlangan antikorlar ishlab chiqarila boshlaydi. Lekin ba'zi hollarda buni qabul qilib bo'lmaydi.
Oʻtkazish usuli
PCR usuli - bemordan ajratilgan namunalarda (in vitro) infektsiyani laboratoriya aniqlash.
Polimeraza zanjiri reaktsiyasini o'tkazish uchun maxsus reagentlar to'plami kerak.
Sinov materiali reaktivlar bilan probirkalarga kiritiladi. Probirkalar maxsus apparatga - kerakli RNK yoki DNK fragmentlarini kuchaytirish (sonini ko'paytirish) uchun mo'ljallangan PCR kuchaytirgichga joylashtiriladi, PCR kuchaytirgichi tsiklik rejimda ishlaydi. Har qanday tsiklda, agar namunalar patogenning RNK yoki DNK ketma-ketligini o'z ichiga olsa, u holda bu nuklein kislotalarning zarrachalarining ko'proq nusxalari eritmada to'planadi. Siz patogen mavjudligini va uning namunalardagi miqdorini aniqlashingiz mumkin.
PCR turlari
PZR boʻyicha sifatli tahlil quyidagi natijani olish imkonini beradi:
- namunada qiziqtiruvchi patogen topilmasa manfiy;
- musbat, agar namunalarda ma'lum bir patogenga xos bo'lgan ketma-ketliklar topilsa.
Ijobiy PCR natijasi bilan biz tashxis qo'yilgan infektsiya borligi haqida 95% aniqlik bilan gapirishimiz mumkin. Shu bilan birga, diagnostika maqsadlarida foydalaniladigan PCR to'plamlarining aniqligi 100% ga etadi.
Odatda noto'g'ri natijalarning 5% inson omili bilan belgilanadi. Masalan, reagentlarni tahlil qilish va saqlash texnikasini buzish tadqiqotning aniqligini sezilarli darajada kamaytirishi mumkin.
Kantitativ PCR virus yuki tushunchasini belgilaydi. Bemordan olingan namunalarda qancha patogen DNK to'plami borligini aniqlash mumkin.
Infektsiyaning og'irligi ularning sonining ko'payishi bilan to'g'ridan-to'g'ri proportsionaldir. Virusli yukni kamaytirish uchun terapiya muvaffaqiyatini ham aniqlashingiz mumkin.
PCR biomateriali uchun topshirish
Kontitativ PCR klinikada, asosan ertalab amalga oshiriladi. Shifokorga tashrif buyurish paytida bemorga nima qilish kerakligi aytiladi: qirib tashlash, smear, siydik yoki qon. PCR materialning ifloslanish darajasidan qat'iy nazar patogenlarni aniqlay oladi.
Ijobiy tahlil uchun, nazariy jihatdan, namunalarda faqat bitta patogenning mavjudligi talab qilinadi. Amalda esa yanada qulayroq sharoit yaratishga harakat qilishadi. Buning uchun ba'zi tavsiyalar mavjud:
- agar ular jinsiy a'zolardan qirib tashlash yoki tampon olishsaa'zolar, tadqiqotdan uch kun oldin yaqin aloqadan saqlanish kerak;
- tahlildan oldin antibakterial preparatlar bilan yuvinish yoki yuvinish mumkin emas;
- Uretradan smear olishdan uch soat oldin siz sabr-toqatli bo'lishingiz va ichaklaringizni bo'shatmasligingiz kerak.
Qon topshirishda ushbu qoidalarga amal qilmang.
Miqdoriy PCR tahlili natijalari qanday izohlanadi?
Olingan natijalarni miqdoriy baholash
Bir qator klinik holatlarda davolanish samaradorligi va / yoki patologiya jarayonining dinamikasi muammosi paydo bo'ladi. Bunday savollar surunkali infektsiyalari (odamning immunitet tanqisligi virusi, gepatit B va C) bilan kasallangan odamlarni tekshirishda ayniqsa dolzarbdir. Tashxis qo'yishda ular amplikonlarning to'planishi (PCR mahsulotlari) tahlil qilinayotgan namunadagi kerakli gen nusxalari mavjudligiga mutanosib ekanligiga asoslanadi.
Albatta, miqdoriy PCR natijalarini hisobga olgan holda, maxsus PCR signallarining intensivligini o'rganish bilan gel elektroforez orqali amalga oshiriladi. Shuningdek, olingan natijalarni to'g'ri miqdoriy baholash uchun zaruriy shart - bu kerakli genning ma'lum miqdordagi nusxalarini o'z ichiga olgan ijobiy ishonchli nazorat namunalari (masalan, bitta PCR reaktsiyasi uchun gepatit C genining ming nusxasi). Miqdoriy nazoratning bir nechta ketma-ket suyultirishlari kalibrlash egri chiziqlarini yaratishga imkon beradi va klinik namunalardagi klinik genokopiyalar tarkibini baholash uchun ishlatiladi.
Miqdoriy PCR ta'rifida asosiy yutuq yaratilish bo'ldilyuminestsent DNK problari oddiy primerlar bilan bir vaqtda reaksiya aralashmasiga qo'shiladi va PCR jarayonini vaqtida kuzatish imkonini beradi, ya'ni real vaqtda PCR.
TaqMan metodologiyasi amplikonning oʻrta qismiga xos boʻlgan va uchlarida ikkita yorliqga ega boʻlgan floresan DNK problarining sintezini nazarda tutadi. Ulardan biri lyuminestsent yorlig'i, ikkinchisi esa bu floresan uchun so'ndiruvchi molekuladir.
Ftorometr va termoblok-kuchaytirgichning gibridi bo'lgan maxsus qurilma har bir probirkada floresansni doimiy o'lchashni amalga oshiradi (real vaqtda PCR printsipi). 20-40 PCR tsiklidan so'ng har bir namuna uchun individual egri chiziqlar olinadi. Sinov namunasidagi kerakli gen nusxalari sonini nazorat namunalari bilan kalibrlash egri chiziqlaridan hisoblash mumkin.
Shuningdek, lyuminestsent usulda PCRni amalga oshirishning muhim xususiyati shundaki, natijalarni hisobga olgan holda PCR aralashmasi bilan naychalarni ochishning hojati yo'q. Bu xonani kuchaytirish mahsulotlari bilan ifloslanish ehtimolini kamaytiradi va elektroforez uchun maxsus ish joylarini ajratishning hojati yo'q.
Miqdoriy PCR transkripti nimani ko'rsatadi?
Nima kashf qilinmoqda?
Miqdoriy PCR kabi usul yordamida genlarda sifat oʻzgarishlari topiladi: kiritishlar, oʻchirishlar va nuqta mutatsiyalari. Ammo ba'zi irsiy kasalliklarda tegishli alomatlar ma'lum genlar tarkibidagi o'zgarishlarga javoban paydo bo'ladi.
RahmatMiqdoriy tahlil raqamli natija beradi, ko'pincha IU / ml da. Bu shuni anglatadiki, bir millilitr sinov namunasida xalqaro birliklarda o'lchangan patogenning RNK yoki DNK nusxalarining ma'lum soni topilgan.
Kattaligiga qarab, infektsiyaning og'irligiga tashxis qo'yiladi. Qon odatda virus yukini aniqlash uchun tekshiriladi, chunki kasallik paytida viruslar qonda erkin harakatlanadi.
Xususiyatlar
Qon testida kantitativ PCR ikkita xususiyatga ega.
- Tahlil hosil boʻlgan PCR mahsuloti tarkibini aniq aniqlash uchun lyuminestsent yoki radioaktiv yorliq bilan belgilangan primerlar yoki deoksiribonukleozid trifosfatlar ishtirokida oʻtkaziladi.
- PZR jarayonida juda koʻp PCR mahsulotlari paydo boʻlishidan oldin reaksiyani erta yakunlang. Buning sababi shundaki, to'yinganlikning oxirgi bosqichida, juda ko'p PCR mahsulotlari mavjud bo'lganda, fermentning o'zi ham, substratlar ham ushbu reaktsiyaning cheklovchi bo'g'inlari sifatida ishlaydi. Bunday sharoitlarda keyingi PCR tsiklining tugashi endi PCR mahsulotlari sonining ikki baravar ko'payishi bilan tavsiflanmaydi, turli xil namunalar o'rtasidagi ahamiyatsiz miqdoriy farqlar tekislanadi, ular bir qator reaktsiya davrlaridan o'tgandan keyin dastlabki bosqichlarda aniq aniqlanadi..
PCR diagnostikasi narxi
PCR tadqiqoti xarajatga ega bo'lib, u qanday infektsiya tekshirilishiga, tahlil metodologiyasiga va test materialiga bog'liq. Bitta infektsiyani aniqlash uchun siz ichkarida berishingiz kerak bo'ladi200-800 rubl. Biomaterialni olish uchun to'lov ham qo'shiladi - taxminan 400 rubl.
